前面寫了原代細胞的取代、分離，今天講述一下原代細胞的培養(yǎng)：

第三節(jié) 原代和傳代細胞的培養(yǎng)和維持   
一、原代細胞的培養(yǎng)與維持   
(一)原代細胞培養(yǎng)   
1、靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養(yǎng))   
凡經(jīng)消化液處理實體組織來源的細胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性，細胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L，培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng)，小牛血清濃度為10%～80%，有條件的應在37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發(fā)生脫落，漂浮。若原代貼壁細胞不是用于長期培養(yǎng)，只是用于分離繁殖或測定病毒之用，其細胞濃度可以加大，盡量貼成厚層以利病毒的效價提高和測定結果（如空斑）更加明顯、準確，待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，此時的pH若有明顯變化，應將原代細胞換液，即倒去舊液，換入新鮮的培養(yǎng)基，以便除去衰老、死亡的細胞和陳舊的培養(yǎng)基，使貼壁細胞能獲得充足的營養(yǎng)。   
若用骨髓或外周血中的懸浮細胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時，可有少量的肌樣纖維間質(zhì)細胞或基質(zhì)細胞開始貼壁生長，為了利于該貼壁細胞充分貼壁和生長，此時換液應將細胞懸液經(jīng)低速離心后，按半量換液方式棄去舊液加入新液，然后再將細胞懸液放入原瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)反復幾次換液后，貼壁肌樣細胞逐漸形成網(wǎng)狀，此時換液可將原懸浮細胞和培養(yǎng)基移入另一新瓶，然后分別補加新鮮培養(yǎng)基(也按半量換液方式分別對半加入新液)繼續(xù)培養(yǎng)，原瓶的貼壁細胞逐漸長成單層，而新瓶中又會出現(xiàn)二次貼壁細胞，經(jīng)幾次換液也會逐漸長成單層，在此類細胞培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中往往需加入少量的維生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清（濃度要在20%以上），以利細胞貼壁生長。   
2、懸浮細胞的培養(yǎng)   
凡來自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結、骨髓的淋巴細胞、造血干細胞以及白血病細胞，在原代培養(yǎng)時要盡量去除紅細胞。若作用于試驗的短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，細胞濃度可在5～8×109/L范圍內(nèi)，然后進行分瓶試驗。若要將淋巴細胞及白血病細胞進行長期培養(yǎng)，淋巴細胞中要加入生長因子，白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細胞生長，待細胞開始增殖甚至結成小團塊，培養(yǎng)基中pH變酸，說明細胞生長繁殖良好，一般每隔3天需半量換液一次（換液時盡量使細胞不丟失），待細胞增殖加快，濃度明顯增加，pH發(fā)生明顯變化時，此時可考慮傳代。但千萬不能急于傳代，一定要待細胞密度較高時才能進行，以防傳代失敗。  

(二)原代細胞的維持   
1、貼壁細胞（包括半貼壁細胞的換液）   
貼壁細胞長成網(wǎng)狀或基本單層時，由于營養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，不適宜細胞生長，此時細胞還未長成單層，未達到飽和密度，仍需繼續(xù)培養(yǎng)，因此，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細胞繼續(xù)生長繁殖的需要。其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量全部培養(yǎng)基。若希望細胞能在較長時間內(nèi)能維持存活，但不需增殖，此時要換成含2%小牛血清的維持液。   
2、懸浮細胞   
凡經(jīng)培養(yǎng)后只在細胞培養(yǎng)基中懸浮生長而不貼壁的細胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細胞的形態(tài)和生長現(xiàn)象，淋巴細胞的短期培養(yǎng)無需換液，但加入生長因子或有絲分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，細胞不僅會發(fā)生轉化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細胞的營養(yǎng)需求，加之代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，細胞不適宜生長，需進行換液。白血病細胞或淋巴瘤細胞體外長期培養(yǎng)時，都需換液培養(yǎng)，待達到飽和密度時才能傳代。換液時，只能采用半量換液的方式，千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進行換液。 
半量換液的方法如下：   
將原培養(yǎng)瓶豎起，在30分鐘內(nèi)，若細胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去，再加入等量的新鮮全部培養(yǎng)基。若細胞不能沉于瓶底，可吸出細胞懸液，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮全部培養(yǎng)基，混勻后再轉入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。   
二、原代細胞培養(yǎng)的第一次傳代   
原代培養(yǎng)后由于懸浮細胞增殖，數(shù)量增加甚至達飽和密度，貼壁細胞的相互匯合，使整個瓶底逐漸被細胞覆蓋，細胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。每進行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代，傳至5～10代以內(nèi)的細胞通常稱為次代培養(yǎng)細胞，傳至10~20代以上的細胞，通常確定為傳代細胞（或稱傳代細胞系）。然而，傳代細胞系的建立，關鍵是初代培養(yǎng)的第一次傳代。 
應注意如下幾點：   
(1)細胞生長密度不高時，或未能達到覆蓋整個瓶底時不能急于傳代。   
(2)原代培養(yǎng)的貼壁細胞多為混雜細胞，形態(tài)各異，往往是上皮樣細胞和成纖維樣細胞并存，采用胰蛋白酶消化時要掌握好消化時間，因成纖維細胞易于脫壁，上皮細胞不易脫壁，因此，可根據(jù)需要選用適當?shù)南瘯r間及時中止消化。在早先傳代時，其消化時間比一般已建系的細胞相對長一些。   
(3)吹打已消化的細胞要輕巧，既不能聽到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形成，以盡可能減少對細胞的機械損傷。   
(4)第一次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些，以利于細胞的生存和繁殖。如果消化分離的細胞懸液有組織塊，也一并傳入到培養(yǎng)瓶，盡量減少細胞損失。   
(5)第一次傳代培養(yǎng)時的pH不能高，寧可偏低一些。此外，小牛血清濃度可適當加大至15%～20%左右。   
三、傳代細胞的傳代培養(yǎng)   
原代細胞經(jīng)傳代后所形成的傳代細胞，可根據(jù)不同細胞采取不同的方法進行細胞傳代。貼壁生長的細胞用消化法傳代，部分貼壁的細胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進行傳代，或用自然沉降法加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進行傳代。后兩種傳代方法比較簡單，唯有貼壁細胞的消化傳代法比較復雜一些。 
現(xiàn)將具體方法介紹如下：   
(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。   
(2)每瓶加入2mL，無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。   
(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02鞹A或混合液），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細胞表面，待細胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜"現(xiàn)象時，倒掉消化液，再繼續(xù)作用2～3分鐘，輕輕搖動，細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時應立即終止消化。   
(4)加入全部培養(yǎng)基5mL，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時要按順序進行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細胞的機械損傷。   
(5)用計數(shù)板計數(shù)，計算細胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當?shù)募毎麧舛群笤俜制颗囵B(yǎng)。   
四、傳代細胞的建系和維持   
細胞系的維持是培養(yǎng)工作的重要內(nèi)容，是通過換液傳代再換液、再傳代和細胞種子凍存來實現(xiàn)的，但對每一個細胞系來說都有其自身的特點，要做好建系的維持須注意以下幾點：   
1.細胞檔案   
細胞檔案要記錄好，如組織來源、生物學特性（由形態(tài)、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等）、培養(yǎng)基的要求、傳代換液時間、擴增時間(分裂指數(shù))，細胞的特殊遺傳標志(標記染色體)等，這些記錄對于保證細胞的正常生長，保持細胞的一致和經(jīng)長期培養(yǎng)細胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。   
2.換液傳代   
(1)細胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規(guī)律性，因而在繼續(xù)傳代時，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性，這樣可以減少由于傳代時細胞密度的頻繁增減或換液時間的不規(guī)律而導致細胞生長特性的改變，給以后的實驗帶來影響。   
(2)多種細胞系維持傳代，要嚴格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉，甚至每個細胞系均需單獨實驗室，傳代時各系均分開單獨操作，每傳5代后，細胞種子均應凍存。傳代時均應作好記錄，培養(yǎng)瓶上要有明顯標記，標記細胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時間。若細胞生長較快，可減去換液程序，每次均可傳代。每個傳代細胞系，最好能分成2～3條線，分別傳代，同時也可在適溫或4℃短期存放一瓶，以防止污染丟失。細胞種子的及時凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細胞變異，此外還可提供不同代次的細胞同時進行對比試驗。   
3.細胞系（或株）的鑒定和管理   
當一個細胞系（或株）建立后，專家鑒定可有可無，按國際慣例，只要認真研究，記錄完整，資料和結果確切，就可在有關雜志上或刊物上報道細胞的各次實驗指標。   
下面為美國標準細胞庫或細胞銀行（ATCC）入庫細胞的基本要求：   
（1）培養(yǎng)簡歷 組織來源日期、物種、組織來源、性別、年齡、供體正常或異常健康狀態(tài)，細胞已傳代數(shù)等。   
（2）凍存液 培養(yǎng)基和保護劑名稱。   
（3）細胞活力 凍融前后細胞接種存活率和生長特性(生長繁殖曲線，分裂指數(shù)等)。   
（4）培養(yǎng)液 培養(yǎng)基種類和名稱、血清來源及濃度。   
（5）細胞形態(tài) 類型，如上皮或成纖維細胞等。   
（6）核型 二倍體或多倍體，標記染色體有或無。   
（7）無污染情況 包括細胞、真菌、支原體、原蟲和病毒等。   
（8）物種檢測 檢測同功酶，主要為G6PD和LDH，以證明細胞有無交叉污染。   
（9）免疫檢測 一兩種血清學檢測。   
（10）細胞建立者 建立者姓名、檢測者姓名。    
第四節(jié) 細胞的純化和克隆   
體外培養(yǎng)的細胞源于人或動物體內(nèi)或胚胎組織，其體內(nèi)的細胞都是混雜生長，每一種組織都有血管和間葉組織，因此，來源于上述組織的培養(yǎng)材料的原代細胞、傳代細胞絕大多數(shù)都呈混合生長，即有上皮樣細胞，又有纖維樣細胞，纖維樣細胞又包括成纖維細胞、肌細胞、骨細胞、滑膜細胞等，混雜的細胞會直接影響實驗結果，而利用體外培養(yǎng)細胞進行實驗研究時，為了保證實驗結果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復性，要求采用單一種類細胞來進行實驗，這樣才能對某一細胞的功能、形態(tài)等變化進行一系列研究，因而培養(yǎng)細胞的純化就成為實驗研究的重要一步，甚至需要從混雜的細胞群中分離出單個細胞來進行培養(yǎng)和開展實驗研究。   
一、細胞的純化   
細胞的純化一般分為兩種，即自然純化和人工純化。可根據(jù)不同細胞種類、來源、實驗要求和目的選擇采用。   
(一)自然純化   
自然純化即利用某一種類細胞的增殖優(yōu)勢，在長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長慢的細胞，靠自然增殖的潛力，最后留下生長優(yōu)勢旺的細胞，達到細胞純化的目的。但這種方法常無法按照需要和實驗要求及目的來選擇細胞，此法花費時間長，留下來的往往是成纖維細胞。僅有那些惡性變的腫瘤細胞或突變的細胞可以通過此方法而保留下來，不斷純化而建立細胞系。   
(二)人工純化   
人工純化，即利用人為手段造成某一細胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其他細胞的生長從而達到純化細胞的目的。   

1、細胞因子依賴純化法   
人和動物組織中某些細胞需要有特殊的細胞因子存在的微環(huán)境才能長期存活和生長繁殖，如IL-2是T細胞生長所必需的細胞因子，BCGF是B細胞的生長因子，體外培養(yǎng)中淋巴細胞若加入IL-2就可使T細胞生長繁殖，形成IL-2依賴的T細胞系，如CTLL-2細胞株，而其他細胞則自然被淘汰，采用此法還建立了IL-6依賴的細胞系，如B9、CTD7細胞株。   
2、酶消化法   
酶消化法是比較常用的純化方法，不僅對貼壁細胞可行，能利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開，達到純化的目的，對貼壁細胞與半貼壁及粘附細胞間的分離純化也是十分有效的。   
（1）上皮細胞與成纖維細胞的分離純化   
兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁，特別是在原代細胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開。 
方法如下：   
①采用常規(guī)消化傳代方式 將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)兩次，每次加1mL（25mL培養(yǎng)瓶）來回輕搖1-2次，使胰蛋白酶流過所有細胞表面，然后倒掉。   
②蓋好瓶塞（或蓋），將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)纖維樣細胞變圓，部分脫落，立即加入2mL有血清的培養(yǎng)液終止消化。   
③用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細胞生長的區(qū)域（可事先在鏡下用記號筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號）。吹打時不要用力，也不要吹打上皮細胞生長區(qū)域。吹打結束后，再用少量培養(yǎng)液漂洗一遍，然后加入適量培養(yǎng)液于瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，也可重復上述操作再進行一次，隔幾日后或下次傳代時，再進行上述操作，經(jīng)過幾次處理，就可將成纖維細胞去除或將兩者分開。   
（2）骨髓基質(zhì)肌樣細胞的純化   
在血液細胞和骨髓細胞靜置培養(yǎng)時，常有許多肌樣細胞和骨髓基質(zhì)細胞貼壁生長，但也有許多淋巴細胞、單核細胞、粒細胞粘附其上，種類混雜，鑒于粘附細胞貼壁不牢固，也可用酶消化法使粘附細胞脫壁分離，以達到骨髓基質(zhì)細胞或血液中肌樣細胞與淋巴細胞分開和純化的目的。 
其方法如下：   
①待基質(zhì)或肌樣細胞基本形成單層時，倒去舊液，加入無鈣、鎂PBS漂洗，并用力搖動后倒掉，反復洗2~3次后，一方面可洗去血清和鈣鎂離子以助酶消化，另一方面又可使大部分粘附細胞被洗掉，但仍留有不少粘附細胞。   
②將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶1mL（25mL培養(yǎng)瓶），輕輕搖動讓胰蛋白酶流過細胞表面，作用1~2分鐘后再輕輕搖動1~2次后倒去。   
③蓋好瓶蓋，在普通顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)或肌樣細胞由于貼壁較牢固未脫壁，而原先粘附的細胞已浮起，此時再加2mL PBS洗一次倒掉，盡量除去粘附細胞。   
④加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，再繼續(xù)用力搖動后倒掉，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。隔幾日或下次傳代前，再進行上述操作，經(jīng)過幾次處理和傳代培養(yǎng)后就可將粘附細胞去除，將兩者分開，達到使骨髓基質(zhì)細胞或肌樣細胞純化的目的。   
3、機械刮除法   
原代培養(yǎng)時,如果上皮細胞和成纖維細胞為分區(qū)成片混雜生長，每種細胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上。可采用機械的方法去除不需要的細胞區(qū)域而保留需要的細胞區(qū)域。

其方法如下：   

(1)將要純化細胞的培養(yǎng)瓶，在凈化室內(nèi)放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進行。   
(2)用硅橡皮刮子在不需要生長的細胞區(qū)域推劃，使細胞懸浮在培養(yǎng)液中，注意不要傷及所需細胞。   
(3)推劃后用培養(yǎng)液沖洗振搖兩次倒掉，即可將培養(yǎng)基加入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。   
(4)數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細胞又長出，可再進行上述操作，這樣反復多次可以純化細胞。操作過程中要嚴格無菌操作，防止污染。   
4、反復貼壁法   
成纖維細胞與上皮細胞相比，其貼壁過程快，大部分細胞能在短時間內(nèi)（大約10~30min）完成附著過程（但不一定全部伸展），而上皮細胞（大部分）在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細胞。 
其方法如下：   
(1)將細胞懸液接種在一個培養(yǎng)瓶內(nèi)（最好培養(yǎng)液內(nèi)不含血清，此時上皮細胞貼壁更慢）靜置20分鐘。   
(2)在倒置顯微鏡下觀察，見部分細胞貼壁，稍加搖動也不浮起時，將細胞懸液倒入另一培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)20min，然后再重復上述操作后，即可將上皮細胞和成纖維細胞分隔開，在第1瓶和第2瓶以成纖維細胞為主，往后幾瓶即以上皮細胞為主，下次傳代時再按上述方法處理，就可使兩者達到全部分開的目的。   
5、電烙篩選法   
在貼壁細胞轉化時，往往在培養(yǎng)瓶的細胞層中會出現(xiàn)分散的轉化灶，轉化灶區(qū)域細胞密集、排列規(guī)則，有明顯生長趨勢，與周邊未能轉化的細胞有明顯的區(qū)域界限，此時即可用機械刮除法去除未轉化細胞，也可用電烙篩選法燙死未轉化細胞而保留轉化灶細胞。 
其方法如下：   
(1)倒去舊液，并用記號筆劃出轉化灶的區(qū)域。   
(2)用加熱的微型電烙器(類似焊接用的電烙鐵)將轉化灶周邊的細胞全部燙死，只保留轉化灶細胞。在單細胞克隆篩選時，也可用此法將單個細胞周圍的細胞殺死，然后在適應性培養(yǎng)基中（50%是舊液）繼續(xù)培養(yǎng)，即可達到純化的目的。   
二、細胞的克隆化   
        細胞克隆技術又稱單個細胞分離培養(yǎng)技術，即從細胞群體中分離出一個細胞，并使其在體外培養(yǎng)體系中能繁殖成新的細胞群體，這種由單個細胞所形成的細胞群（或集落）稱為一個克隆，這種純化后的細胞群體稱為細胞株。它們當中每個細胞的遺傳特征和生物學特性極為相似和一致，有利于對不同群體細胞的形態(tài)和功能進行比較和研究。若該細胞株只是一般傳代、無一系列實驗鑒定指標，則為一般細胞株。若有一系列實驗指標報道的，則稱為限定性細胞株，如由幼地鼠腎細胞系（BHK21）第13孔的單個細胞形成的細胞株稱BHK-21C-13（代表克隆13），其形態(tài)規(guī)則，特性穩(wěn)定，便于研究。   

        單一細胞體外培養(yǎng)能否生長繁殖最后形成克隆，這與各細胞克隆形成率有關，如果細胞克隆形成率偏低（小于10%）應采用一些措施，如改用胎牛血清，適應性培養(yǎng)基添加刺激因子（如胰島素、地塞米松、細胞生長因子等），調(diào)節(jié)CO2濃度以控制pH。若貼壁效果差可選用適當?shù)倪m應性底物（如膠原層或血漿纖維蛋白層），以及制備底層的飼養(yǎng)細胞。用X線或60Co照射處理的細胞層，如雞胚細胞、骨髓基質(zhì)細胞，該細胞照光后只有代謝功能，無增殖和傳代能力，或選用短壽的細胞，常選用鼠腹水巨噬細胞作飼養(yǎng)細胞，用于單克隆抗體雜交瘤細胞的克隆化。
具體克隆方法如下：   
1.毛細管法：   
將一定量的細胞懸液（如105/mL或更低）稀釋至1個細胞/mL，取10mL稀釋的細胞懸液，用直徑為0.5mm，長為8mm的毛細玻璃管若干（30～50只），在負壓作用下，使懸液吸入各毛細管中，在倒鏡下檢查出每管只進入一個細胞的毛細管，然后放入適應性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由一個細胞在毛細管繁殖后，并向管外擴展，并形成單個克隆的細胞群體。   
2.有限稀釋法   
有限稀釋法采用梯變倍數(shù)稀釋的原則，將稀釋的細胞懸液接種于微孔培養(yǎng)板中（也可在板上的96孔中直接稀釋）培養(yǎng)一定時間后，孔中可出現(xiàn)單個細胞克隆，本法不需特殊設備，操作簡單快速，適合大批量克隆化培養(yǎng)。現(xiàn)已廣泛用于異質(zhì)性細胞系的克隆化培養(yǎng)、誘導和分離耐藥性或高轉移性、或突變細胞株以及單克隆抗體雜交瘤細胞株的克隆篩選中。 
具體方法如下：  
（1）取對數(shù)生長期的細胞制成懸液(貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)，測定活細胞數(shù)及濃度（細胞存活率及單個細胞百分率應高于90%以上）。   
（2）將細胞懸液在試管中稀釋，用培養(yǎng)基將細胞稀釋至50個細胞/mL、10個細胞/mL、5個細胞/mL，將3種稀釋度的細胞分別接種于96孔板中，每孔為0.1mL，于37℃ 5%CO2下培養(yǎng)。   
（3）次日在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細胞數(shù)，挑選只含一個細胞的孔，做好標記并補加0.1mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。   
（4）培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)，待長至孔底面的1/3～1/2時，可用消化法將96孔中的單一克隆的細胞分別移至24孔板中進行擴大培養(yǎng)。  

3.平皿克隆分離法   
        在平皿內(nèi)將單個細胞形成克隆并進行分離培養(yǎng)的方法如下：   
(1)將對數(shù)生長期細胞制備單個細胞懸液（懸浮細胞用吸管吹打分散，貼壁細胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度，使5mL培養(yǎng)液內(nèi)含有50～200個細胞（細胞存活率及單個細胞百分率應大于90%以上）。   
(2)將上述細胞懸液迅速移入60mm平皿中，在37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1周或更長。若有明顯的克隆形成時方可進行克隆分離，方法有兩種：   
①套環(huán)法：在倒置顯微鏡下觀察克隆形成的情況， 標記單個克隆周邊，吸干培養(yǎng)基，用涂有少量無菌硅脂的無菌金屬套環(huán)，套住標記的克隆，在套環(huán)內(nèi)滴加少量0.25%胰蛋白酶，待細胞脫離時，用注射器針頭輕輕吹打分散后，轉入小平皿或24孔板或6孔板中擴大培養(yǎng)。   
②玻片法：在接種細胞懸液前，預先在60mm平皿中放入無菌小玻片，加入細胞懸液，培養(yǎng)一定時間后，在倒置顯微鏡下標記上含一個克隆的玻片，然后用無菌鑷子取出標記玻片轉入24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。   
4.軟瓊脂克隆分離法   
本法僅適用于懸浮培養(yǎng)的類淋巴細胞或惡性程度高的貼壁細胞，而正常貼壁細胞在軟瓊脂中不能形成克隆。   
（1）將對數(shù)生長期的細胞制成單個細胞懸液(貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成單個細胞)作活細胞計數(shù)。調(diào)整細胞濃度至1×106細胞/L，然后根據(jù)實驗要求再作梯倍稀釋。通常以1~5×104個細胞/L為佳。   
（2）制備底層瓊脂 取5%瓊脂置沸水中，使瓊脂全部溶化，取出一份5%瓊脂，移入小燒杯中，待冷至50℃，迅速加入9份預溫37℃的新鮮培養(yǎng)液（即成為0.5%瓊脂），混勻后立即注入24孔培養(yǎng)板中，每孔含0.5% 瓊脂0.8mL，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。   
（3）制備上層瓊脂 取37℃保溫的、不同濃度的細胞懸液9.4mL，移入小燒杯中，加入50℃ 5% 瓊脂0.6mL迅速混勻，即配成0.3%瓊脂培養(yǎng)基，立即澆入鋪有底層瓊脂的24孔培養(yǎng)板中，每孔0.8ml，置室溫使瓊脂凝固。   
（4）于37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1~2周或更長，若需培養(yǎng)更長時間可補加0.8mL/孔含瓊脂的培養(yǎng)液，待有明顯集落形成為止。   
（5）集落（克隆）計數(shù)：在倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)直徑大于75μm或含有50個細胞以上的克隆。  

5．單細胞顯微操作法   
借助顯微操縱器，在顯微鏡監(jiān)控下將單個細胞逐個吸出，移入含有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)。本法準確性好，如無顯微操縱器可自制毛細吸管替代。

方法如下：   
（1）飼養(yǎng)層細胞的制備 單個細胞在極低密度下生長非常緩慢，甚至難以分裂，為了促進克隆細胞的生長繁殖，常采用飼養(yǎng)層細胞，飼養(yǎng)細胞種類和制備方法依實驗要求而定，現(xiàn)以3T3小鼠纖維細胞為例：   
①用0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長的3T3細胞，調(diào)整細胞濃度為108細胞/L，在96孔板中每孔加入0.1mL細胞懸液于37℃ 5% CO2中培養(yǎng)至單層。   
②將已形成單層的3T3細胞板，用60Co γ線以4000～6000拉得輻射或在培養(yǎng)液中加入mitomycin（終濃度為10-6mol/L）作用16h。其目的是使細胞有絲分裂能力喪失，但仍可短期存活，有代謝功能，不僅可維持pH而且還可為克隆細胞提供必要的養(yǎng)分及刺激生長的因子。飼養(yǎng)細胞處理后需更換新鮮培養(yǎng)液。   
(2)制備單個細胞懸液 方法同上。   
(3)分離單個細胞 其方法多樣，可根據(jù)實驗條件決定：   
①毛細管吸入法 同上述毛細管法，在顯微鏡下將只有一個細胞的毛細管取出。   
②微滴法 將經(jīng)稀釋至103個細胞/L的單個細胞懸液，用無菌的1mL注射器逐滴加在平皿中制成散滴，在顯微鏡下挑選出單個細胞的液滴，再用毛細管取出單個細胞懸滴。   
③液體石蠟法 將經(jīng)稀釋至103個細胞/L的單個細胞懸液，用無菌的1mL注射器逐滴加入充滿無菌液體石蠟的平皿底部，在倒置顯微鏡下挑選只有一個細胞液滴，仔細用毛細吸管取出有一個細胞的液滴。   
④玻璃小球附著法 將稀釋至103個細胞/L的細胞懸液加入表面涂有無菌凡士林石蠟的小玻璃珠的平皿中，混勻后，在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個細胞的玻珠，仔細用鑷子取出。   
(4)將采用上述方法分離出的單個細胞，放入預先制備飼養(yǎng)層細胞的96孔培養(yǎng)板中，于37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1~2周或更長。   
(5)待細胞克隆明顯，并使孔底覆蓋1/3～1/2時，即可將細胞轉種于24孔板進行擴大培養(yǎng)（貼壁細胞仍需用0.25%胰酶消化法取出轉種）。